Управляемые факторы риска прогрессии ВПЧ-ассоциированных цервикальных плоскоклеточных интраэпителиальных неоплазий

Введение

Рак шейки матки (РШМ) остается одной из наиболее значимых медицинских и социальных проблем женского репродуктивного здоровья [1]. Известно, что в глобальном масштабе во всем мире каждые 40 секунд одна женщина умирает от данного заболевания [2]. С 2008 г. доказана роль ВПЧ как основного этиологического фактора цервикальных интраэпителиальных неоплазий (CIN) и инвазивного рака. В связи с этим наиболее перспективной стратегией в цервикальном скрининге считается сочетанное проведение ВПЧ-типирования и цитологического исследования эпителиальных клеток шейки матки, регламентированное российскими клиническими рекомендациями 2020 г. и Приказом Минздрава РФ №1130н. Согласно данным документам, у молодых пациенток с LSIL (признаки ВПЧ инфекции, койлоцитоз) или пациенток, планирующих беременность, предпочтительна выжидательная тактика с динамическим наблюдением за состоянием шейки матки в течение 18–24 месяцев в виде цитологического контроля 1 раз в 6 мес. и ВПЧ-тестирования 1 раз в год. Хирургическое лечение рекомендуется в случае отсутствия регрессии через 18–24 мес.^{1 2}

Рядом исследований установлено, что персистенция ВПЧ, развитие CIN и РШМ зависят от метилирования генов-супрессоров опухолевого роста. После внедрения в клетку ВПЧ использует донаторы метильных групп человека (фолаты и витамин В₁₂), что ведет к значительному повышению синтеза онкобелков Е₆ и Е₇, которые стимулируют клеточную пролиферацию, препятствуют апоптозу раковых клеток, блокируют выработку интерферона, нарушают протективные регуляторные механизмы репарации ДНК, что в целом дестабилизирует геном. Для снижения экспрессии генов онкобелков в клетках, инфицированных ВПЧ, необходим оптимальный уровень фолатов [3][4].

Известно, что активно пролиферирующие клетки (кроветворные и эпителиальные) чутко реагируют на нарушение процесса репликации, возникающее при дефиците фолатов, что сопровождается нарушением гемопоэза (анемией, тромбоцитопенией и лейкопенией), а также высоким риском развития злокачественных новообразований, вследствие нарушения пролиферации эпителиальных клеток кожных покровов и слизистых. Доказанной является также роль низкого уровня фолиевой кислоты в повышении риска ряда других состояний, включающих нарушения эмбриогенеза, нейродегенеративных и сердечно-сосудистых заболеваний [5][6].

Однако исследования, устанавливающие ассоциативные связи между риском развития или прогрессии CIN и концентрацией фолатов в сыворотке крови ограничены и представлены лишь зарубежными авторами прошлого десятилетия [7-9].

В связи с высокой распространённостью ВПЧ, естественной историей его течения, возможностью как регрессировать, так и прогрессировать поиск информативных прогностических маркёров, позволяющих сформировать группы «высокого» и «низкого» риска реализации инфицирования ВПЧ в цервикальные плоскоклеточные интраэпителиальные поражения, представляет научный и практический интерес.

Цель исследования — выявить информативные маркёры прогрессии цервикальных плоскоклеточных интраэпителиальных поражений низкой степени.

Материалы и методы

Обследовано 127 пациенток, у которых 6 месяцами ранее в ходе рутинного цервикального скрининга в амбулаторных лечебных учреждениях г. Ростова-на-Дону был выявлен позитивный тест типирования ВПЧ высокого канцерогенного риска (ВКР). У 44 женщин инфицированность ВПЧ ВКР не сопровождалась цервикальными интраэпителиальными поражениями плоского эпителия (NILM), у 83 больных (65,4%) выявляли цервикальные интраэпителиальные неоплазии плоского эпителия низкой степени (LSIL). Для всех пациенток в соответствии с актуальными клиническими рекомендациями была избрана выжидательная тактика, а именно динамическое наблюдение, регламентирующее повторное консультирование спустя 6 месяцев.

Анализ ВПЧ-тестирования 127 пациенток показал, что наиболее распространённой была инфицированность 16, 18 и 33 генотипами, которые были выявлены у 90 женщин (70,9%) и в структуре ВПЧ ВКР составляли соответственно 43,2%, 16,3% и 17,1%.

Для выбора дальнейшей тактики ведения 90 пациенток по прошествии 6 месяцев с момента первичного обследования был проведен сравнительный анализ динамики лабораторных и инструментальных методов диагностики шейки матки (цитологическое исследование цервикального мазка, молекулярно-биологическое исследование отделяемого из цервикального канала на ВПЧ с проведением генотипирования и определения вирусной нагрузки, расширенная кольпоскопия, иммуноцитохимическое исследование соскоба шейки матки с определением белка p16INK4a).

Полученные результаты выявили значимые отличия в исходах динамического наблюдения, которые определили распределение пациенток в три клинические группы.

У 43 из 90 пациенток (47,8%), составивших I группу, был выявлен регресс заболевания. Во II группу вошли 30 из 90 пациенток (33,3%) с персистенцией заболевания — отсутствием значимых изменений в результатах лабораторных и инструментальных методов исследования. III группу составили 17 из 90 пациенток (18,9%) с прогрессом заболевания.

В исследуемых группах проанализированы жалобы и состояние микробиоты влагалища на момент консультирования, возраст пациенток, половой дебют, социальный статус больных с анализом промискуитета и семейного положения, применение методов контрацепции, гинекологический и акушерский анамнез, перенесенные экстрагенитальные заболевания, сывороточный уровень концентрации витамина В₉.

Критерии включения в исследование — возраст от 18 до 49 лет, позитивный цервикальный ВПЧ-тест на наличие 16, 18 и 33-го типов, наличие цервикального интраэпителиального поражения плоского эпителия низкой степени (LSIL), либо его отсутствие (NILM), информированное согласие пациентки.

Критерии исключения — верифицирование цервикального интраэпителиального поражения высокой степени (HSIL), введение интравагинально любых лекарственных средств, приём иммуномодуляторов, противовирусных и антибактериальных препаратов в течение 6 месяцев, беременность и лактация, отказ от участия в исследовании.

Для жидкостной цитологии шейки матки клеточный материал получали из зоны трансформации и цервикального канала с помощью Cervex-Brush. Интерпретацию результатов осуществляли согласно классификации TBS (The Bethesda System) [10].

Генотипирование ДНК ВПЧ типов высокого канцерогенного риска 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 и 59, выделенных из клинических проб проводили с помощью набора «РеалБест ДНК ВПЧ ВКР генотип», методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе CFX-96 «REAL TIME» (Bio-Rad США).

Оценку состояния экзо- и эндоцервикса проводили с помощью расширенной кольпоскопии по стандартной методике с помощью оптического кольпоскопа Carl Zeiss E. (Germany). Полученные данные интерпретировали согласно Международной классификации кольпоскопических терминов³.

Определение сывороточного уровня концентрации фолиевой кислоты проводили однократно утром натощак с 08:00 до 11:00 часов методом хемилюминесцентного иммуноанализа на микрочастицах, Architect i2000(Abbott) с использованием набора реагентов ADVIA Centaur FOL производства Siemens Healthcare Diagnostics (Германия). Референсные значения концентрации фолиевой кислоты — 3,1–20,5нг/мл.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов параметрического и непараметрического анализа с использованием программ IBM SPSS Statistics 28.0.1.1 (разработчик — IBM Corporation), STATISTICA 13.5.0.17 (разработчик — StatSoft.Inc) и пакет MedCalc 20.027.

Для сравнения межгрупповых различий использовали непараметрический критерий Краскала-Уоллиса для независимых выборок с поправкой Бонферрони. Для нахождения решающих правил с помощью пакета SPSS применяли алгоритм RANFOR (случайный лес) и TREE (деревья классификации). Сравнение номинальных данных проводилось при помощи критерия χ² Пирсона.

Связь между явлениями оценивали расчётом коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Для прогнозирования определенного исхода заболевания применяли метод анализа ROC-кривых. Качество прогностической модели, оценивали исходя из значений площади под ROC-кривой со стандартной ошибкой и 95% доверительным интервалом (ДИ) и уровня статистической значимости.

Результаты

Структура жалоб пациенток на момент консультирования была представлена сопоставимой частотой патологических влагалищных выделений (p>0,005, χ2=4,218), ощущений зуда и жжения во влагалище и в области наружных половых органов (p>0,005, χ2=5,302), диспареунии (p>0,005, χ2=3,437). Доли пациенток с отсутствием жалоб в исследуемых группах значимо не различались (p>0,005, χ2=2,371).

Возраст исследуемых пациенток находился в диапазоне от 21 до 49 лет. Распределение пациенток по пятилетним возрастным периодам не выявило значимых межгрупповых отличий (p>0,05, χ2=8,641). При этом в I группе (с регрессом заболевания) доля женщин в возрасте от 21 до 24 лет была наибольшей и превышала таковую во II и III группах в 2,1 раза.

Изучение социального статуса, семейно-брачных отношений и промискуитета не выявило значимых межгрупповых отличий (соответственно (p>0,005, χ2=2,651 и p>0,005, χ2=3,597). Однако наибольшая доля незамужних пациенток с частой сменой половых партнеров была в III группе (с прогрессией заболевания), что отражено в табл. 1.

Среди пациенток исследуемых групп большинство было некурящими (p>0,005, χ2=1,027). При этом наиболее часто приверженность к табакокурению выявлена у пациенток III группы (41,2% против 30,0% во II и 27,9% в I группе).

У пациенток всех исследуемых групп возраст менархе находился в диапазоне от 10 до 13 лет и значимо не различался (p>0,005, χ2=2,167). С наибольшей частотой во всех клинических группах начало менструальной функции приходилось на период от 12 до 13 лет.

Исследование параметров менструального цикла также не выявило значимых межгрупповых отличий по длительности менструального цикла, продолжительности менструального кровотечения и его объёму (p>0,005, χ2=1,472). Различные нарушения менструального цикла у пациенток исследуемых групп встречались с сопоставимой частотой (p>0,005, χ2=5,035).

При анализе полового дебюта, приведенного в табл. 2, который анализировали по периодам от 12 до 14 лет, 15–17 годам, 18 и более лет, выявлено, что в I группе возраст такового было значимо более поздним, чем во II и III группах (p<0,0001, χ2=12,82).

Аналитическое изучение использование средств защиты от нежелательной беременности продемонстрировало закономерно низкую частоту использования барьерных методов во всех исследуемых группах. Прием КОК с наибольшей частотой отмечен у пациенток I и II групп (60,5% и 53,3% соответственно). Предпочтительными методами контрацепции для пациенток III группы (с прогрессией заболевания) были внутриматочные средства и прерванный половой акт (29,4%). В этой же группе неиспользование методов защиты от нежелательной беременности встречалось у 5,9% пациенток. Несмотря на некоторые особенности по используемым средствам контрацепции, значимых отличий между исследуемыми группами выявлено не было (p>0,005, χ2=10,3).

Сравнительный анализ данных акушерского анамнеза показал, что пациентки исследуемых групп не имели значимых отличий по паритету беременностей (p>0,005, χ2=3,605) и родов (p>0,005, χ2=1,841). В каждой из клинических групп у большинства женщин в анамнезе были беременности (соответственно по группам — 69,8%; 80,0% и 64,7%), которые практически у каждой второй пациентки завершились родами (48,8%; 50,0% и 41,5%).

Анамнестические данные о перенесённых гинекологических заболеваниях не обнаружили значимых отличий по частоте встречаемости различных нозологий (p>0,005, χ2=3,611). Эти данные отражены в табл. 3.

Достоверных различий в нарушении влагалищной микробиоты в анамнезе (бактериальный вагиноз, аэробный вагинит) (p>0,005, χ2=1,12) (p>0,005, χ2=5,73) у пациенток в исследуемых группах выявлено не было. ИППП (хламидиоз, трихомониаз, гонококковую инфекцию) в анамнезе с наибольшей частотой отмечали у пациенток II и III групп (43,3% и 52,9% против 25,6% в I группе). В I группе доля женщин с неотягощённым инфекционным анамнезом была наибольшей (p>0,05, χ2=2,965).

Соматический анамнез был также сопоставимо отягощен различными экстрагенитальными заболеваниями (p>0,005, χ2=2,724) и отражен в табл. 4.

Лабораторное обследование состояния влагалищной микробиоты при обращении пациенток не выявило значимых различий между исследуемыми группами (p>0,005, χ2=2,305) Из табл. 5 следует, что при этом в I группе (с регрессом заболевания) сочетанные формы неспецифических инфекционных заболеваний влагалища (бактериальный вагиноз (БВ), аэробный вагинит (АВ), кандидозный вульвовагинит (КВВ) выявляли в 4 раза реже по сравнению со II (персистенция инфекции) и III (прогресс заболевания) группами.

Результаты исследования вагинального отделяемого на наличие воспалительной реакции продемонстрировали, что в III группе (с прогрессией заболевания) отмечалась наибольшая по сравнению с I и II группами частота воспалительной реакции влагалища (в 4,4 раза). Данные результаты продемонстрированы в табл. 6. Значимо большая доля пациенток с физиологическим уровнем рН влагалищной жидкости выявлена в группе женщин с регрессом заболевания (p<0,002, χ2=3,512).

Исследование вирусной нагрузки, одного из критериев стратификации пациенток по клиническим группам, показало принципиальные различия, указанные на рис. 1. Через 6 месяцев динамического наблюдения в I группе отмечено отсутствие клинически значимых концентраций ВПЧ-ВКР (более 10⁵ геномных эквивалентов). Частота пациенток с клинически малозначимым уровнем вирусной нагрузки (менее 10^3-5 геномных эквивалентов ВПЧ ВКР) сократилась в 3,2 раза (90,7% женщин) (p<0,003, χ2=1,341). Доля женщин с клинически незначимой вирусной нагрузкой (менее 10³ геномных эквивалентов ВПЧ-ВКР) увеличилась в 2,4 раза (p<0,002, χ2=1,413) (рис. 1). У данных пациенток также отмечалась нормализация результатов цервикального мазка и кольпоскопической картины, отсутствовала экспрессия белка p16INK4a (рис. 2).

Во II группе (с персистенцией заболевания) значимые изменения в параметрах лабораторных и инструментальных методов исследования не выявлены (рис. 1). Результаты цитологии цервикального эпителия (LSIL), частота выявления аномальных кольпоскопических картин I степени, а также уровень вирусной нагрузки и экспрессия белка p16INK4a не имели значимых отличий в динамике наблюдения. Суммарно наибольшую долю на момент консультирования, как и 6 месяцами ранее составляли больные с клинически малозначимой и незначимой нагрузкой ВПЧ ВКР (соответственно 90,0% и 93,3% пациенток) (рис. 1). Частота обнаружения экспрессии онкобелка р16ink4a не отличалась от предыдущей и выявлена соответственно у 16,7% и 13,3% пациенток данной группы.

В III группе (с прогрессом заболевания) выявлено значимое по сравнению с I и II группами увеличение (в 2,7 раза) вирусной нагрузки ВПЧ ВКР до уровня клинически значимого и выше (10⁵ и более геномных эквивалентов ВПЧ-ВКР) (p<0,001, χ2=39,192) (рис. 1). У данных больных цитологические изменения цервикального эпителия и аномальные кольпоскопические картины соответствовали стойким изменениям в пределах LSIL. Также отмечалась значимо более высокая экспрессия белка p16INK4a по сравнению с группами сравнения (p<0,001, χ2=24,4) (рис. 2).

Результаты проведённого сравнительного клинико-статистического анализа пациенток с ВПЧ-ассоциированными LSIL, а также оценка диагностической значимости полученных экспрессионных данных с помощью ROC-анализа не продемонстрировали достаточной прогностической значимости отличительных параметров, которые можно было бы использовать в качестве предикторов исхода заболевания: регресса, персистенции или прогрессии. Площадь под кривой составляла 0,768.

Учитывая низкий прогностический потенциал ряда параметров, отличающих больных исследуемых групп, были исследованы сывороточные концентрации витамина В₉ (фолиевой кислоты) как возможного информативного параметра риска прогрессии цервикальных плоскоклеточных интраэпителиальных неоплазий.

В I группе (с регрессом заболевания через 6 месяцев), уровень фолиевой кислоты оказался значимо более высоким, по сравнению со II группой (соответственно 17,59±1,069 и 8,91±1,996; p=0,0003), а также с III группой (с прогрессией заболевания), в которой концентрация этого параметра в сыворотке крови была наименьшей (2,98±0,112; p= 0,0001).

Оценка диагностической значимости полученных экспрессионных данных с помощью ROC-анализа продемонстрировала достаточную прогностическую значимость совокупности параметров (ранний половой дебют, цитологическое обнаружение LSIL, уровень вирусной нагрузки ВПЧ ВКР≥10⁵ геномных эквивалентов ВПЧ ВКР, экспрессия онкобелка p16INK4a, сывороточный уровень фолиевой кислоты менее 3,1 нг/мл), которые можно рассматривать маркерами прогрессии заболевания. Площадь под кривой составила 0,849. При сравнении площадей под ROC-кривыми при проведении сравнительного клинико-статистического анализа следует, что при учете сывороточного уровня фолиевой кислоты прогностическая значимость модели прогноза прогрессии заболевания выше.

Обсуждение

Распространённость LSIL варьируется в диапазоне от 1,6 до 7,7 % женской популяции репродуктивного возраста, что указывает на социальную значимость разработки и применения четких алгоритмов ведения таких пациенток. Поскольку большинство случаев LSIL завершается спонтанной регрессией, зарубежные и отечественные клинические рекомендации активной лечебной тактики не предполагают [11].

По данным проведенного исследования факторами, значимо отличающими пациенток с персистенцией или прогрессией цервикальных интраэпителиальных поражений низкой степени от женщин с регрессом заболевания являются более ранний возраст полового дебюта, обнаружение атипических изменений цервикального эпителия низкой степени, клинически значимый уровень вирусной нагрузки ВПЧ ВКР, а также обнаружение экспрессии белка p16INK4a.

При этом проведённый клинико-статистический анализ пациенток не позволил ответить на ряд вопросов. Почему при сопоставимости большинства анамнестических данных и катамнеза сценарий ВПЧ ассоциированных цервикальных интраэпителиальных поражений низкой степени у одних пациенток реализовался в прогрессию заболевания, а у других нет? Какие механизмы лежат в основе роста вирусной нагрузки (10⁵ и более геномных эквивалентов ВПЧ ВКР)? Что определяет более выраженную экспрессию в пораженном ВПЧ цервикальном эпителии белка p16INK4a, чувствительного показателя перехода легких потенциально обратимых повреждений (LSIL) в тяжёлые?

В настоящее время рядом многочисленных исследований установлено, что низкий уровень фолиевой кислоты связан с повышенным риском ряда состояний (дефектов нервной трубки, сердечно-сосудистых заболеваний, анемии) [12][13].

Убедительно доказано, что фолаты, химические соединения на основе фолиевой кислоты, незаменимы для синтеза нуклеотидов и репликации ДНК, которые являются основными обменными процессами, обеспечивающими физиологическое деление и нормальный рост всех клеток человеческого организма [14]. Обсуждается причастность фолатного статуса и к развитию некоторых видов рака — колоректального, молочной железы и быстро растущего числа его других локализаций, таких как лёгкие, поджелудочная железа, желудок, пищевод, лейкемия, кожа и эндометрий [15].

Выводы

В нашем исследовании установлена взаимосвязь концентраций витамина В₉ с уровнем копийности ВПЧ ВКР, а также с активностью экспрессии белка p16INK4a, что позволяет рассматривать сывороточный уровень фолиевой кислоты в качестве информативного фактора, играющего значимую роль в прогнозе течения цервикальных плоскоклеточных интраэпителиальных неоплазий низкой степени⁴. Уточнение роли фолатного статуса в установлении индивидуального риска персистенции ВПЧ, развития цервикальных дисплазий, а также их прогрессии представляет важный инструмент мониторинга за ВПЧ-инфицированными пациентками. Полученные результаты обосновывают необходимость выбора тактических вариантов ведения пациенток на основе достаточно точного метода прогнозирования прогрессии LSIL, который, не нарушая алгоритма актуальных клинических рекомендаций, позволят снизить риск реализации инфицирования ВПЧ в клиническую форму заболевания.